商品屬性：
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貨號(hào) |
規(guī)格 |
產(chǎn)品名稱 |
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A-PJ1165-300μg |
300μg |
T4 UvsX Recombinase |
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A-PJ1165-3mg |
3mg |
T4 UvsX Recombinase |
儲(chǔ)存條件：
T4 UvsX Recombinase 置于-20°C 可保存 1 年，-80°C 長(zhǎng)期保存，短期使用置于 4°C，保存一個(gè)月，避免反復(fù)凍融。
產(chǎn)品介紹：
UvsX 重組酶，來(lái)源于 T4 噬菌體，是 RecA/Rad51家族的同源體。RecA/Rad51 重組酶家族在雙鏈 DNA 斷裂的無(wú)誤修復(fù)和復(fù)制叉重新啟動(dòng)的過程中起到重要作用。
T4 UvsX 重組酶可與其他重組酶一起錨定在單鏈 DNA 上并激活其在其他雙鏈 DNA 上尋找同源序列，以進(jìn)一步完成鏈置換。經(jīng)檢測(cè)，該酶無(wú)核酸酶活性。
質(zhì)量控制：
熱失活：60°C，10min。
酶儲(chǔ)存液：50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM
EDTA, 10% Trehalose, pH 7.5。2xRPA BufferMix：包含反應(yīng)緩沖鹽、ATP、磷酸肌酸、dNTP、PEG、DTT、BSA 等，可用于 RPA 擴(kuò)增試驗(yàn)。該試劑 4°C
條件下放置 1 個(gè)月性能無(wú)下降。
基于本蛋白進(jìn)行 RPA 反應(yīng)測(cè)試的全套試劑
用于 RPA 擴(kuò)增的測(cè)試引物與探針
CPV-F（20uM） CACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAG
CPV-R（20uM） AGTTTGTATTTCCCATTTGAGTTACACCACGTCT
Probe（10uM） CCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGT[dT-BHQ1]
[THF][dT-FAM]ATAGGAGTTCAACAAG -(C3)
Canine parvovirus type 2,VP2
加入 1μl 的模板 DNA，上機(jī)反應(yīng)前加入 1.25 μl 的 280 mMMg(OAC)2（終濃度 14 mM），總反應(yīng)體積 25 μl?；旌暇鶆?，并離心，置于 39-42℃條件下反應(yīng) 30min。
2. 進(jìn)行熒光 RPA 擴(kuò)增在進(jìn)行熒光檢測(cè)時(shí)體系中，額外加入 0.3 μl 的 10μM Probe（120 nM的終濃度）和 50U 的 Exonuclease III（2U/μl 的終濃度），即可進(jìn)行熒光檢測(cè)。本方法應(yīng)用原理為 ExoIII 切割 THF 位點(diǎn)，使熒光與猝滅基團(tuán)分離，報(bào)告熒光信號(hào)。
特別說明：
（1） 以上 RPA 擴(kuò)增測(cè)試屬于蛋白功能性測(cè)試，按照以上實(shí)驗(yàn)操作流程，可獲得 RPA 擴(kuò)增產(chǎn)物。進(jìn)一步的優(yōu)化，包括：X、Y、GP32、聚合酶、反應(yīng) Buffer，甚至加樣順序，均可能進(jìn)一步提高 RPA 的擴(kuò)增性能。
（2）關(guān)于 DNA 聚合酶的選擇， 測(cè)試了三種常見的 DNA聚合酶，在進(jìn)行熒光法測(cè)定時(shí)，推薦的選擇順序依次為 Bst 4.0>Bsu> Sau，且在 42℃條件下，總能獲得*快的擴(kuò)增速度，且熒光信號(hào)更強(qiáng)。在 Basic 擴(kuò)增中 Sau 表現(xiàn)出特異性擴(kuò)增能力更佳。
（3）關(guān)于 RPA 的靈敏度與非特異擴(kuò)增，在 Basic 試劑的擴(kuò)增中，仍然存在非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，這需要進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)組分及引物序列。在使用熒光探針法時(shí)，但由于特異性探針的存在，非特異擴(kuò)增產(chǎn)物通常無(wú)熒光信號(hào)值，但此時(shí)會(huì)影響檢測(cè)靈敏度。GP32 蛋白的
濃度增加會(huì)顯著降低非特異性擴(kuò)增，但會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增速度減緩，此時(shí)需要同步增加 X 與 Y 蛋白的用量，以維持 RPA 的擴(kuò)增速度。
（4）據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在進(jìn)行試紙條 RPA 實(shí)驗(yàn)時(shí)，傾向使用 Nfo 內(nèi)切酶又名 Endonuclease IV， 來(lái)對(duì)擴(kuò)增探針進(jìn)行切割，但 未予測(cè)試，目前無(wú)法提供相應(yīng)參數(shù)。
（5）RPA 反應(yīng) Buffer 對(duì)擴(kuò)增至關(guān)重要，輕微的濃度差異，均可導(dǎo)致擴(kuò)增效率大幅下降，甚至失敗。RPA BufferMix 為粘稠試劑，使用時(shí)務(wù)必保證加樣準(zhǔn)確，Tip 頭中的殘液務(wù)必完全打入 EP 管中。
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