實驗材料： 

1. 50ml 配制好的RPMI1640培養(yǎng)液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶 

2. 100ml燒杯2個；
3、50ml離心筒2個 

4、培養(yǎng)皿1個，細胞培養(yǎng)瓶1個 

5、1ml ，200μl移液器各1支；槍頭盒2個；無菌玻璃攪拌棒1個 

6、細胞計數(shù)板1塊； 

7、滅好菌的鑷子1把，剪刀1把； 

8、酒精燈1臺；

形態(tài)特性：上皮細胞樣

生長特性：貼壁生長

特征特性：HCCCS-9810細胞株源自一位女性肝膽管細胞癌患者。HCCCS-9810細胞呈上皮細胞樣，染色體模式數(shù)為71，但染色體數(shù)目可以在22-117的范圍內(nèi)變動。倍增時間為20.4小時。AFP，CA-A和CA19-9的分泌水平低，在裸鼠中的成瘤率為20%。

培養(yǎng)條件：RPMI-1640(GIBCO,添加NaHCO31.5g/L,glucose2.5g/L,SodiumPyruvate0.11g/L)，90%；胎牛血清，10%。氣相：空氣，95%；二氧化碳，

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凍存培養(yǎng)基：

凍存細胞時必須使用推薦的凍存培養(yǎng)基。凍存培養(yǎng)基中應(yīng)含有DMSO 或者甘油等冷凍保護劑。還可使用專門配制的完全凍存培養(yǎng)基。

1）細胞凍存培養(yǎng)基是一種用于哺乳動物細胞的即用型完全凍存培養(yǎng)基，其所含胎牛血清和牛血清比例經(jīng)過優(yōu)，可改善細胞活力以及解凍后的細胞復(fù)蘇效果。 

2）凍存培養(yǎng)基是一種化學成分確定的、無蛋白、無菌凍存培養(yǎng)基，含10% DMSO，適用于多種干細胞和原代細胞 (黑色素細胞除外) 的凍存。

培養(yǎng)細胞凍存方案：

以下實驗方案介紹了培養(yǎng)細胞凍存的一般流程。詳細的實驗方案，必須參閱針對具體細胞的產(chǎn)品說明書。 

1.配制凍存培養(yǎng)基，于2°C至8°C下儲存，直至使用。請注意使用何種凍存培養(yǎng)基取決于所用細胞系。

2.凍存貼壁細胞時，利用傳代時所用方法輕柔地使細胞從組織培養(yǎng)容器上脫離下來。用該細胞所需完全培養(yǎng)基重新懸浮細胞。

3.采用血球計數(shù)器、細胞計數(shù)儀按照臺盼藍拒染法或者使用自動細胞計數(shù)儀測定總細胞數(shù)和活細胞百分比。根據(jù)所需活細胞密度，計算凍存培養(yǎng)基需要量。

4.以大約100-200×g的離心力將細胞懸液離心5至10分鐘。在無菌條件下小心倒掉上清液，不要攪動細胞沉淀。

注：離心速度和時間取決于細胞種類。

5.用預(yù)冷的凍存培養(yǎng)基重新懸浮細胞沉淀，將其調(diào)整至該細胞適合的活細胞密度。

6.將細胞懸液分裝到若干凍存管中。分裝時，應(yīng)不時輕輕混合細胞，使其保持均勻的細胞懸液狀態(tài)。

7.使用可控制降溫速度的冷凍裝置冷凍細胞，使溫度每分鐘大約降低1°C?；蛘?，將裝有細胞的凍存管放入凍存盒中，然后將凍存盒置于-80°C條件下過夜。 
3-氟酰 98%AP36(Human Apelin 36) ELISA Kit  人Apelin 36兔阿黑皮素原(POMC)酶聯(lián)吸附測定試劑盒

間二酰 99%Tn-T(Human Troponin T) ELISA Kit  人肌鈣蛋白T兔抗乙酰膽堿受體抗體(Anti-AChR)酶聯(lián)吸附測定試劑盒

對酰 98%ES-Ab(Human anti-Endostatin antibody) ELISA Kit  人血管內(nèi)皮抑素抗體兔血小板型果糖激酶(PFKP)酶聯(lián)吸附測定試劑盒

對二酰 99%Agtr I a(Human angiotensin II receptor type I a) ELISA Kit  人血管緊張素Ⅱ受體Ⅰa型兔血小板衍生生長因子AA(PDGF-AA)酶聯(lián)吸附測定試劑盒

乙酰 98%ANGPTL3(Human angiopoietin-like protein 3) ELISA Kit  人血管**素樣蛋白3兔腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF) 酶聯(lián)吸附測定試劑盒

4'-叔丁-4-丁酰 98%Alpha Actin(Human Alpha-Actin) ELISA Kit  人α肌動蛋白兔核因子κB (NFκB)酶聯(lián)吸附測定試劑盒

維生素K1 98%ANKRD1(Human cardiac ankyrin repeat domain 1) ELISA Kit  人心肌錨蛋白重復(fù)域1兔膠原酶I(Collagenase I)酶聯(lián)吸附測定試劑盒  

5-己炔-1- 96%LEPR(Human Leptin Receptor) ELISA Kit  人瘦素受體兔XIV型膠原 (COL14)酶聯(lián)吸附測定試劑盒

1-辛炔 99%AT2R(Human Angiotensin II Receptor 2) ELISA Kit  人血管緊張素Ⅱ受體2兔谷氨半胱氨連接酶修飾亞(GCLM)酶聯(lián)吸附測定試劑盒

對酰  >98.0%(GC)ANG II R-1(Human angiotension II receptor 1) ELISA Kit  人血管緊張素Ⅱ受體1兔精氨酶(Arg)酶聯(lián)吸附測定試劑盒

間酰 97%ANG-4(Human Angiopoietin 4) ELISA Kit  人血管**素4兔糖原合成酶激酶3β(GSK3β)酶聯(lián)吸附測定試劑盒

鄰酰 98%sMHC-1(Human soluble myosin heavy chain 1) ELISA Kit  人可溶性肌球蛋白重鏈1兔CC趨化因子受體1(CCR1)酶聯(lián)吸附測定試劑盒

二烷 CP，98%HSF-1(Human Heat Shock Factor 1) ELISA Kit  人熱休克因子1兔神經(jīng)肽Y(NPY)酶聯(lián)吸附測定試劑盒

二烷 99%VPI(Human vasopeptidase inhibitors) ELISA Kit  人血管活性肽酶抑制劑兔過氧化物酶體增殖物激活受體γ( PPAR-γ)酶聯(lián)吸附測定試劑盒

對酰 98%CMLC-1(Human Cardiac myosin-light chains 1) ELISA Kit  人心肌肌凝蛋白輕鏈1兔生長調(diào)節(jié)致癌因β(GROβ)酶聯(lián)吸附測定試劑盒  
膽管細胞型肝癌細胞；HCCCS-9810骨成型蛋白Elisa試劑盒堿性酶（AP）標記的兔抗親和素OCT1  陽離子轉(zhuǎn)運器1抗體

可溶性甘露糖結(jié)合凝集素2Elisa試劑盒膠體金標記的兔抗親和素Oct-1  胚胎干關(guān)鍵蛋白1抗體

膜受體蛋白Elisa試劑盒辣根過氧化物酶標記的兔抗親和素OCLN/Occludin  緊密連接蛋白抗體

網(wǎng)狀蛋白4Elisa試劑盒Cy5.5標記的兔抗親和素OCIAD2  卵巢癌反應(yīng)抗原抗體

網(wǎng)狀蛋白4BElisa試劑盒Cy7標記的兔抗親和素OCIAD1  卵巢癌反應(yīng)抗原抗體

含主要協(xié)助轉(zhuǎn)運蛋白超家族域蛋白2AElisa試劑盒PE標記的兔抗親和素OCEL1  緊密連接蛋白/小分子膠原蛋白OCEL1抗體

NDUFB4Elisa試劑盒Cy3標記的兔抗親和素OCC1  結(jié)腸癌過度表達蛋白1抗體

NDUFB8Elisa試劑盒Cy5標記的兔抗親和素OAT4L/URAT1  尿鹽重吸收轉(zhuǎn)運子1抗體

化過氧化物酶體增殖因子活化受體γElisa試劑盒生物素標記的兔抗親和素OAT-3  陰離子轉(zhuǎn)運蛋白-3抗體
細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）準備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號21875-091)，90%；胎牛血清，10%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲存。

二．細胞處理：

1）復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。