PCR試驗試劑與耗材對檢測質(zhì)量：

在PCR檢測質(zhì)量控制中，試劑的選擇具有十分重要的作用，也是實驗人員為關(guān)注的檢測質(zhì)量控制因素。試劑一定選擇質(zhì)量和信譽(yù)好的**，一但選定后不要輕易改換。如果必須改換時應(yīng)與原產(chǎn)品進(jìn)行嚴(yán)格比對試驗，包括敏感性、特異性、試劑保存期等試驗。并且經(jīng)常要注意不同批次產(chǎn)品質(zhì)量的差異。比如說TaqDNA聚合酶，不同廠家**的質(zhì)量是有差異的，盡管都是標(biāo)出相同活性單位，但其標(biāo)定方法和保存液的成分以及運(yùn)輸過程的不同常常導(dǎo)致實際活性單位是有差異的，有時由于其活性低，使得弱陽性樣品漏檢；有時由于其活性過高出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。這與ELISA檢測中酶結(jié)合物的作用相似。其實影響PCR檢測結(jié)果的試劑很多，可以這樣說，PCR檢測用的所有試劑都可能影響檢測效果?？刂圃噭┑馁|(zhì)量是作好PCR檢測前提。我們認(rèn)為：是選擇PCR試劑盒來控制試劑質(zhì)量。

評價一種PCR試劑盒，除了考慮它的敏感性、特異性、穩(wěn)定性、操作簡便程度外，還應(yīng)包括：試劑盒提供的試劑覆蓋整個PCR檢測試驗的程度。如果試劑盒提供了整個PCR檢測試驗的試劑，表明該試劑盒對PCR檢測試驗的試劑具有了全程控制性能。相反，PCR檢測的試劑的質(zhì)量控制程度比較低，意味著檢測質(zhì)量可控程度低。例如：溴化乙錠僅僅起熒光染料的作用，如果在陽光下長時間的照射下失效了，在紫外燈下發(fā)熒光效能降低，可能會造成一些弱陽性樣品的漏檢，出現(xiàn)假陰性。其它試劑出現(xiàn)問題也是一樣影響檢測質(zhì)量。試劑盒在**過程中，有一套試劑**質(zhì)量控制體系。每一試劑組分都經(jīng)過靈敏度、敏感性、特異性質(zhì)量控制的檢測，在有效期內(nèi)能確保每種試劑的質(zhì)量。因此，選擇試劑盒進(jìn)行PCR檢測是比較理想的控制方法。在PCR檢測中，全部使用試劑盒提供試劑，對PCR檢測質(zhì)量控制有益。

實驗耗材也是影響PCR檢測質(zhì)量的因素之一。PCR反應(yīng)管薄厚以及傳導(dǎo)熱量性能等直接影響PCR檢測效果。在熱蓋PCR儀上一般不需要加入礦物油，但有些PCR反應(yīng)管蓋子不嚴(yán)密，導(dǎo)致擴(kuò)增過程中反應(yīng)液水份蒸發(fā)，嚴(yán)重影響檢測靈敏度。PCR反應(yīng)體系是微量的，移液器的Tip頭**質(zhì)量不好時，有時致使液體殘留量多或洪吸作用強(qiáng)，導(dǎo)致試劑盒中試劑量不夠，配置PCR反應(yīng)體系不準(zhǔn)，造成檢測質(zhì)量下降。

在每次PCR檢測時，一定設(shè)立陰性對照樣品和陽性對照樣品。陰性對照樣品檢測為陰性時，表明試驗全部過程的試劑沒有受到污染；陽性對照樣品檢測為陽性時，表明DNA提?。≧NA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄）、DNA擴(kuò)增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對照樣品和陽性對照樣品檢測結(jié)果成立的前提下，才能對檢測樣品進(jìn)行判定。因此，每次試驗都應(yīng)設(shè)立表明DNA提?。≧NA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄）、DNA擴(kuò)增和電泳鑒定對照，只有設(shè)立試驗全程的對照，才能證明試驗結(jié)果成立。這一點對PCR和RT-PCR檢測試驗是非常重要的。

陽性對照在試劑盒中是必須有的組分。設(shè)立陽性對照有3種類型：第1種是用檢測的病原微生物作為陽性對照。這樣的直接對照優(yōu)點是直觀、準(zhǔn)確、本次試驗完整條件對照，可以說明此次試驗是否成立。缺點是對檢測過程中增加了PCR污染的指數(shù)。另外，不能表明每個檢測樣品對照成立。第2種是設(shè)立一種與檢測病毒無關(guān)微生物作為陽性對照。優(yōu)點是降低了PCR污染的危險性，并且提高了試劑盒的生物安 全性。缺點是僅是參考陽性對照，不夠直接、完全反映本次試驗成立，也不能表明每個檢測樣品對照成立?？蛇m合怕污染的實驗室或要求生物安 全等級高的病原微生物的檢測。第三種是在每個反應(yīng)管內(nèi)設(shè)立參考對照，除了陽性擴(kuò)增帶之外，又設(shè)立一條擴(kuò)增帶，指示每個反應(yīng)管內(nèi)檢測情況。檢測為陽性時出現(xiàn)兩條不同大小擴(kuò)增帶，陰性時出現(xiàn)一條擴(kuò)增帶。這種對照設(shè)立技術(shù)要求高，成本也高些，對照效果是理想的，可以排除每個檢測樣品操作失誤或試劑出現(xiàn)問題對檢測造成的影響。由于在一個反應(yīng)管內(nèi)對兩條模板同時進(jìn)行擴(kuò)增，相互之間多少有一定的干擾，因此，對病原微生物檢測靈敏度或多或少有一定影響。此種對照方式可能會成為PCR對照的發(fā)展趨勢。